组织免疫荧光步骤

（一）制片
选无自发性荧光的石英玻片或普通优质玻片,洗净后浸泡于无水乙醇和乙醚等量混合液中,用时取出用绸布擦净,将待检样品如组织块剪成适当大小印压于玻片上,也可采用冰冻切片或石蜡切片样品, （二）固定
除研究细胞表面抗原或不稳定抗原可不固定外,一般均应固定,固定的作用有三:①防止标本从玻片上脱落；②除去防碍抗原—抗体结合的类脂,使抗原抗体结合物易于获得良好的染色结果；③固定的标本易于保存,如组织切片固定后在-20℃下可保存一年而不改变其染色特性,
标本的固定原则是:①不能损伤细胞内的抗原；②不能凝集蛋白质；③不能损伤细胞形态；④固定后应保持细胞膜的通透性,以允许抗体进入与抗原结合,
生物帮上面有详细的介绍,
表 常用抗原物质的固定方法 连接转化原理,DNA连接转化步骤,DNA连接转化技术,DNA连接转化试剂,DNA酶切,DNA凝胶回收,DNA连接转化阳性克隆的验证,

（一）制片 选无自发性荧光的石英玻片或普通优质玻片,洗净后浸泡于无水乙醇和乙醚等量混合液中,用时取出用绸布擦净,将待检样品如组织块剪成适当大小印压于玻片上,也可采用冰冻切片或石蜡切片样品,（二）固定 除研究细胞表面抗原或不稳定抗原可不固定外,一般均应固定,固定的作用有三:①防止标本从玻片上脱落；②除去防碍抗原—抗体结合的类脂,使抗原抗体结合物易于获得良好的染色结果；③固定的标本易于保存,如组织切片固定后在-20℃下可保存一年而不改变其染色特性,标本的固定原则是:①不能损伤细胞内的抗原；②不能凝集蛋白质；③不能损伤细胞形态；④固定后应保持细胞膜的通透性,以允许抗体进入与抗原结合,表 常用抗原物质的固定方法抗原物质 固定剂 固定条件（min） 蛋白质抗原 95%～100%乙醇 室温3～10 酶、激素 丙 酮 4℃ 30 免疫球蛋白 四氯化碳 病 毒 丙酮、四氯化碳、无水乙醇 室温5～10或4℃ 30～60 多糖、细菌等 微火加热,甲醇、10%甲醛、丙酮 室温5～10或4℃ 30～60 类 脂 （异嗜性抗原） 10%甲醛,10%佛茂尔（ForMol） 室温3～10 （三）水洗固定后以冷的0.01Mol/L pH7.4PBS液浸泡冲洗,最后以蒸馏水冲洗,防止自发性荧光,（四）染色染色分直接染色法与间接染色法,1． 材料与试剂（1）荧光抗体,稀释至应用浓度,（2）0.01Mol/L pH7.4PBS液（3）9份优质甘油加1份pH7.4PBS液即为甘油缓冲液,甘油有减少非特异性荧光的作用,（4）带盖方盘2．直接染色法（1）将固定好的玻片置于湿盘中,滴加荧光抗体染色液,以覆盖为度,加盖,37℃感做30 min～45min,（2）PBS冲洗3次,每次冲洗3min,即3×3ˊ冲洗,（3）蒸馏水冲洗,（4）滴甘油缓冲液一滴,封片,荧光显微镜检查,2． 间接染色法（1） 检查抗原:①取固定标本,加已知的免疫血清,37℃孵育30min；②以PBS液3×3ˊ冲洗；③再加荧光标记的抗抗体,37℃孵育30min；④PBS 3×3ˊ冲洗；⑤H2O冲洗,凉干；⑥加甘油缓冲液,封片、镜检,（2） 检查抗体:①以免疫后动物的淋巴组织涂片,自然干燥,甲醇固定；②滴加相应抗原液（按1﹕100～1﹕500稀释）,37℃孵育30min；③PBS液3×3ˊ冲洗；④加荧光抗体,37℃孵育30min；⑤PBS液3×3ˊ冲洗；⑥水洗,凉干；⑦加甘油缓冲液,封片、镜检,（五）结果显示 荧光显微镜所观察到的图象,主要以两个指标判断结果,一个是形态学特征；另一个是荧光的亮度,在结果的判定中,必须将二者结合起来,综合判定, 荧光强度的表示方法如下: ＋＋＋ ～ ＋＋＋＋:荧光闪亮,呈明显的亮绿色, ＋＋ :荧光明亮,呈黄绿色, ＋ :荧光较弱,但清楚可见, ± :极弱的可疑荧光, － :无荧光,（六）标本保存由于荧光色素和蛋白质分子的稳定性都是相对的,因此随着保存时间的延长,在各种条件影响下,标记蛋白可能变性解离,失去其应有的亮度和特异性,因此给标本的保存带来一定的困难,所以在标本进行荧光染色之后应立即观察, 保存的方法可采取以下几种:①固定标本片以后低温保存,随用随染；②染色片采取优质封固剂,如特别的荧光封固剂或碱性优质纯甘油固剂等封固,这些封固剂能防止荧光激发,封固后低温保存；④可以采用拍照保存照片